PhiC31整合酶介导的定点转基因系统

概述

        PhiC31整合酶介导的定点转基因系统是在果蝇中应用噬菌体PhiC31整合原理、构建特定位点转基因品系的系统。PhiC31整合酶识别特征序列attP(噬菌体结合位点)和attB(细菌结合位点),促使两段序列之间发生高效且不可逆的整合反应。将含attB序列的质粒注射入特定位点含attP序列的果蝇胚胎,在PhiC31整合酶作用下得到转基因品系,目的片段位于attLattR之间(反应不可逆)。

       如果attP品系不含PhiC31整合酶基因,我们采用M{vas-int.Dm}ZH-2A (RFP+, GFP+)作为PhiC31整合酶的基因组来源;如果转基因品系的筛选标记是荧光表现型,我们可能采用P{nos-phiC31\int.NLS}Xy+, 无荧光表现型)作为PhiC31整合酶基因组来源,如果是后者的情形,请告知我们。

       以vermilion+为筛选标记的情形,例如,为了创建稳定的attP-gRNA品系,您可以采用下面列表中v+背景、attP在常染色体上的品系。我们注射后的G0代成虫与y-v-杂交后筛选v+ G1代,交付您的v+ G2代转基因品系与从v-背景的 attP品系得到的相同。如果v+ 转基因需要在X染色体上,请选用X染色体v-背景的attP品系,例如BDSC#34769。这只是常规的Plan HPlan I 服务,附加vermilion+筛选。您也可以请我们保留attP-gRNA品系,它与Cas9品系杂交后的 F1代胚胎用于Plan RG/RH/RI服务。


P{CaryP}系统
     
Calos实验室通过P-element转基因方法创建了含P{CaryP}attP序列 (位点处有y+) 的两个品系。

        Perrimon实验室继续构建了一系列含P{CaryP}attP序列的品系,并以luciferase为报告基因比较了不同组织中的位置效应 (Position Effect)

        Bellen实验室创建了一个在Y染色体上含P{CaryP}attP序列的品系。

        详细信息请查看参考文献

PhiC31-RMCE系统

       Wu实验室创建了含P{attP.w+.attP}盒式结构的品系,这样含{attB.目的片段.attB}盒式结果的质粒注射入胚胎,在PhiC31整合酶作用下,通过盒式交换反应得到{attR.目的片段.attR}转基因品系。之后Bateman实验室创建了平衡子上P{attP.w+.attP}盒式结构的品系

       详细信息请查看参考文献。

P[acman]系统

        Bellen实验室创建了P[acman]系统,包括一系列attP位点品系(位点处有y+,并首先应用了含双复制子的attB-BAC质粒 (oriS确保BAC稳定地低拷贝复制和同源重组用;而oriV在条件诱导下高拷贝复制,用以制备质粒) 和“Gap-repair”同源重组技术。

        Bellen实验室构建了平均大小为21 kb83 kb两个P[acman] BAC质粒库,保存于CHORI BACPAC

        详细信息请查看参考文献、Bellen实验室网站CHORI BACPAC Resources 网站
      
http://flypush.imgen.bcm.tmc.edu/lab/index.html

         https://bacpacresources.org/library.php?id=444

         https://bacpacresources.org/library.php?id=445

FlyC31系统
      
Basler和Karch实验室创建了一系列含M{3xP3-RFPattP}序列的位点品系。并构建了M{vas-int.Dm}ZH-2A品系,其PhiC31整合酶基因经过果蝇密码子优化,用于PhiC31整合酶的基因组来源。BDSC保存的FlyC31 attP品系已带有M{vas-int.Dm}ZH-2A

        FlyC31 attP品系及其质粒载体含有loxP序列,在转基因完成后可通过Cre/loxP重组反应,切除非必要序列 {3xP3-RFPw+、载体DNA序列等},只保留loxP-目的片段-attL序列。

        为了含Fluorescence标记的质粒可以选用FlyC31系统的attP位点,我们通过Cre/loxP反应切除了原始位点的3xP3-RFP序列,构建了对应位点的NF 品系 (位点处没有RFP)

         详细信息请查看参考文献、FlyC31网站和我们网页上的列表。

       http://www.flyc31.org/

MiMIC系统
     
MiMIC系统由BellenHoskinsSpradling实验室联合创建,是基于Minos转座子构建的位点遍布基因组且功能多样的系统,MIMIC品系的两端含attP盒式结构两端含attB盒式结构的质粒注射入胚胎,在PhiC31整合酶作用下通过盒式交换反应将目的片段插入选定位点。

         详细信息请查看参考文献和Bellen实验室网站MiMIC 页面:
      
http://flypush.imgen.bcm.tmc.edu/pscreen/technique.html 

关于以下列表中大多数PhiC31品系不含PhiC31整合酶基因的说明

      为了保证长期传代的稳定性,大多数情况下我们保存和采用的是不含PhiC31整合酶基因的attP品系,例如,多数FlyC31 attP品系去除了M{vas-int.Dm}ZH-2A。注射时所用的胚胎是attP品系与含PhiC31整合酶基因的品系杂交后的后代。

关于PhiC31系统和Gateway载体系统的特别说明

      “Gateway-PhiC31质粒载体例子为FlyC31系统的Gateway attB 载体请注意Gateway载体(例如Murphy 实验室的The Drosophila Gateway?  Vector collection) attP1attP2attB1attB2PhiC31系统的attPattB概念不同。


参考文献:

Groth A, Fish M, Nusse R, Calos MP (2004) Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage PhiC31. Genetics 166: 1775

Markstein M, Pitsouli C, Villalta C, Celniker SE, Perrimon N (2008) Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nature Genetics 40: 476

Szabad J, Bellen HJ, Venken KJT (2012) An Assay to Detect In Vivo Y Chromosome Loss in Drosophila Wing Disc Cells. G3 (Bethesda) 2(9): 1095

Bateman JR, Lee AM, Wu C-t (2006) Site-specific transformation of Drosophila via PhiC31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics 173: 769

Sun FF, Johnson JE, Zeidler MP, Bateman JR (2012) Simplified Insertion of Transgenes Onto Balancer Chromosomes via Recombinase-Mediated Cassette Exchange. G3 2: 551

Venken KJT, He Y, Hoskins RA, Bellen HJ (2006) PhiC31: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in Drosophila melanogaster. Science 314: 1747

Bischof J, Maeda RK, Hediger M, Karch F, Basler K (2007) An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific PhiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci USA 104: 3312

Venken KJT, Schulze KL, Haelterman NA, Pan H, He Y, Evans-Holm M, Carlson JW, Levis RW, Spradling AC, Hoskins RA, Bellen HJ (2011) MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods 8(9): 737


PhiC31整合系统果蝇品系

P{CaryP}品系

位点名称 BDSC# 基因型 Cytosite#

转基因品系

眼睛颜色1

转基因效率评分[平均值(BACs)]2
attP18 32107 y1 w67c23 P{CaryP}attP18 6C12 橙色 3.4 (0.0)
attP4 -
y1 w67c23 P{CaryP}attP4 12C6 橙色 2.1 (0.0)
attP3 32230 y1 w* P{CaryP}attP3 19C4 淡橙色 0.7 (0.7)
attP40 - y1 w67c23; P{CaryP}attP40 25C6 红色 7.2 (4.2)
attP30 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP30 29C3 红色 2.5 (nd)
attP14 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP14 36A10 橙色 1.7 (1.0)
attP337 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP33 50B6 橙色 4.8 (1.3)
attP167 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP16 53C4 红色 4.5 (1.6)
attP1 8621 y1 w67c23; P{CaryP}attP1 55C4 红色 4.5 (2.2)
attP23 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP23 60C7 红色 - (nd)
attP88 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP88 64A12 红色 - (nd)
attP2 8622 y1 w67c23; P{CaryP}attP2 68A4 红色 5.4 (2.0)
attP112 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP112 68C13 红色 4.0 (nd)
attP10 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP10 85D8 橙色 0.7 (nd)
attP64 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP64 89B9 红色 4.7 (nd)
attP527 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP52 89B11 ?
- (nd)
attP154 -
y1 w67c23; P{CaryP}attP154 97D2 橙色 5.0 (1.8)
attPY 41124 y1 w*/Dp(2;Y)G; P{CaryP}attPY Y 红色 5.9 (nd)
# FlyBase Drosophila melanogaster (R6.10)

1眼睛颜色是转基因品系在杂合状态下羽化三天后观察的结果

2转化效率评分是基于过往实际订单的统计结果, 分别显示了所有订单的平均值和>30 kb BAC质粒的评分值

7Service WPCR确认转基因位点)对该位点不适用


PhiC31-RMCE品系

位点名称
参考 BDSC#
基因型
Cytosite#
果蝇品系
眼睛颜色
3

转基因效率

2

JB37B
P{attP.w+.attP}JB37B
37B7
红色
6.8
JB38F
P{attP.w+.attP}JB38F
38F1
橙色
5.8
JB53F
P{attP.w+.attP}JB53F
53F8
橙色
2.6
JB89B
P{attP.w[+].attP}tara[JB89B]
89B8
红色
6.3
38451
w1118; Dr1/TM3, P{attP.w+.attP}FS10 Sb1 Ser1
79A2
橙色
2.0
38452
w1118; Dr1/TM3, Sb1 Ser1 P{attP.w+.attP}FS18
100D1
橙色
2.0
38453
y1 w*; snaSco/CyO, P{attP.w+.attP}J04
37B8
橙色
8.0
38454
y1 w*; snaSco/CyO, P{attP.w+.attP}J08
37F2
红色
4.6
38455
FM7h, P{attP.w+.attP}FS2/C(1)DX, y1 f1
10B6
红色
2.3
38456
FM7h, P{attP.w+.attP}FS5/C(1)DX, y1 f1
6F3
橙色
3.0

# FlyBase Drosophila melanogaster (R6.10)

2转化效率评分是基于我们过往实际订单的统计结果, 显示了所有订单的评分值

3眼睛颜色是羽化三天后观察的结果。这是果蝇品系自身的眼睛颜色而不是转基因品系的眼睛颜色


P[acman]品系

位点名称
BDSC#
基因型
Cytosite#
转基因品系
眼睛颜色
1
转基因效率评分[平均值 (BACs)]2
VK10
97294
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00010
chromosome 2
-
- (nd)
VK15
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00015
chromosome 2
3.7 (2.4)
VK38
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00038
5B8
2.9 (1.1)
VK06
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00006
19E7
淡橙色
1.8 (1.3)
VK37
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00037
22A3
橙色
4.7 (2.3)
VK12
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00012
25A3
淡橙色
1.0 (nd)
VK02
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00002
28E7
5.9 (3.1)
VK11
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00011
40E4
0.3 (0.0)
VK14
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00014
43A1
橙色
6.1 (3.0)
VK16
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00016
47C6
橙色
2.8 (0.0)
VK30
9747
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00030
50E1
橙色
3.3 (1.4)
VK18
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00018
53B2
橙(斑驳)
6.0 (2.7)
VK22
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00022
57F5
橙色
5.0 (3.2)
VK01
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00001
59D3
橙色
4.3 (4.3)
VK31
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00031
62E1
橙色
5.9 (2.7)
VK33
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00033
65B2
5.1 (3.8)
VK39
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00039
67E4
-
4.8 (nd)
VK19
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00019
68D2
4.2 (1.9)
VK23
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00023
70A2
4.4 (3.8)
VK36
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00036
70C4
- (nd)
VK05
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00005
75A10
橙色
6.2 (2.4)
VK13
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00013
76A2
5.3 (4.4)
VK21
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00021
76C5
橙色
- (nd)
VK07
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00007
82A1
橙色
2.1 (0.0)
VK32
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00032
85A2
淡橙色
2.0 (0.0)
VK40
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00040
87B10
7.8 (1.2)
VK27
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00027
89E11
7.1 (1.8)
VK28
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00028
92F1
橙色
6.8 (2.0)
VK26
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00026
96F3
淡橙色
3.1 (3.8)
VK20
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00020
99F8
淡橙色
5.3 (4.1)
VK24
97424
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00024
101F1
0.0 (nd)

# FlyBase Drosophila melanogaster (R6.10)

1眼睛颜色是转基因品系在杂合状态下羽化三天后观察的结果

2转化效率评分是基于过往实际订单的统计结果, 分别显示了所有订单的平均值和>30 kb BAC质粒的评分值

4这些品系很难得到转基因品系


FlyC31品系

位点名称
参考 BDSC#
基因型
CytoSite#
转基因品系
眼睛颜色
1
转基因效率评分 [平均值 (BACs)]2
ZH-2A
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-2A
2A3
橙色
2.8 (0.6)
ZH-22A
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-22A
22A2
淡橙色
5.1 (3.4)
ZH-51C
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-51C
51C1
淡橙色
7.2 (5.1)
ZH-51D
M{3xP3-RFP.attP}ZH-51D
51D9
6.0 (2.4)
ZH-58A
M{3xP3-RFP.attP}ZH-58A
58A3
淡橙色
7.2 (5.5)
ZH-68E
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-68E
68E1
淡橙色
6.8 (3.5)
ZH-86Fa
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-86Fa
86E18
7.0 (3.8)
ZH-86Fb
M{3xP3-RFP.attP}ZH-86Fb
86F8
7.1 (4.0)
ZH-96E
244876,7
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-96E (with M{vas-int.Dm}ZH-2A)
96E10
淡橙色
2.5 (nd)
ZH-102D
2448810
M{3xP3-RFP.attP}ZH-102D (with M{vas-int.Dm}ZH-2A)
102F4
7.1 (4.0)
24480NF
-
24480NF8 ZH-2A
2A3
橙色
2.0 (nd)
24481NF
-
24481NF9 ZH-22A
22A2
淡橙色
- (0.0)
24482NF
-
24482NF9 ZH-51C
51C1
橙色
0.5 (nd)
24483NF
-
24483NF9 ZH-51D
51D9
5.4 (nd)
24484NF
-
24484NF9 ZH-58A
58A3
淡橙色
1.7 (nd)
24485NF
-
24485NF9 ZH-68E
68E1
淡橙色
1.1 (0.0)
24486NF
-
24486NF9 ZH-86Fa
86E18
3.0 (nd)
24749NF
-
24749NF9 ZH-86Fb
86F8
7.7 (nd)

# FlyBase Drosophila melanogaster (R6.10)

1眼睛颜色是转基因品系在杂合状态下羽化三天后观察的结果

2转化效率评分是基于过往实际订单的统计结果, 分别显示了所有订单的平均值和>30 kb BAC质粒的评分值

5位点受临近hibris基因Enhancer trap影响,不适用于报告基因的分析研究或异位表达 (ectopic expression)造成影响的情况。

6果蝇品系弱(注射后存活率低

7Service WPCR确认转基因位点)对该位点不适用

8去除M{vas-int.Dm}ZH-102DloxP-3xP3-RFP,即位点为M{loxP. attP’}的品系

9去除M{vas-int.Dm}ZH-2AloxP-3xP3-RFP即位点为M{loxP. attP}或M{loxP. attP’}的品系

10Plan I/J 不适用


其它品系

位点名称
BDSC#
基因型
CytoSite#
转基因品系
眼睛颜色
1
转基因效率评分[平均值(BACs)]2
su(Hw)attP8
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP8
8E10
3.2 (0.0)
su(Hw)attP6
3476711
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP6
24A2
3.0 (nd)
su(Hw)attP5
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP5
50F1
5.8 (nd)
su(Hw)attP4
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP4
67E2
2.0 (nd)
su(Hw)attP1
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP1
87B13
5.6 (nd)
su(Hw)attP2
3476111
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP2
92D9
3.5 (nd)
-
3476912
y1 P{CaryIP}su(Hw)attP8 v1
8E10
-
6.0 (nd)
VIE260B
P{attP,y+,w3'}VIE-260B
2L
8.7 (nd)
JK22C aka JMK-96
-
w1118; P{CaryP}JK22C
22C3
4.6 (0.0)
JK73A aka JMK-97
-
w1118; P{CaryP}JK73A
65C3
4.7 (0.0)
JK65C aka JMK-98
-
w1118; P{CaryP}JK65C
66B4
4.9 (0.0)
JK66B aka JMK-99
-
w1118; P{CaryP}JK66B
73A9
5.4 (1.2)

# FlyBase Drosophila melanogaster (R6.10)

1眼睛颜色是显微注射、筛选得到的转基因品系在杂合状态下羽化三天后观察的结果

2转化效率评分是基于过往实际订单的统计结果, 分别显示了所有订单的平均值和>30 kb BAC质粒的评分值

7Service WPCR确认转基因位点)对该位点不适用

11非特异性整合率较高,建议选用Service WPCR确认转基因位点)

12该品系适于筛选标记为vermilion+attP位点在X染色体的转基因服务