概述
PhiC31整合酶介导的定点转基因系统是在果蝇中应用噬菌体PhiC31整合原理、构建特定位点转基因品系的系统。PhiC31整合酶识别特征序列attP(噬菌体结合位点)和attB(细菌结合位点),促使两段序列之间发生高效且不可逆的整合反应。将含attB序列的质粒注射入特定位点含attP序列的果蝇胚胎,在PhiC31整合酶作用下得到转基因品系,目的片段位于attL和attR之间(反应不可逆)。
如果attP品系不含PhiC31整合酶基因,我们采用M{vas-int.Dm}ZH-2A (RFP+, GFP+)作为PhiC31整合酶的基因组来源;如果转基因品系的筛选标记是荧光表现型,我们可能采用P{nos-phiC31\int.NLS}X(y+, 无荧光表现型)作为PhiC31整合酶的基因组来源,如果是后者的情形,请告知我们。
以vermilion+为筛选标记的情形,例如,为了创建稳定的attP-gRNA品系,您可以采用下面列表中v+背景、attP在常染色体上的品系。我们将注射后的G0代成虫与y-v-杂交后筛选v+ G1代,交付您的v+ G2代转基因品系与从v-背景的 attP品系得到的相同。如果v+ 转基因需要在X染色体上,请选用X染色体v-背景的attP品系,例如BDSC#34769。这只是常规的Plan H 或Plan I 服务,附加vermilion+筛选。您也可以请我们保留attP-gRNA品系,它与Cas9品系杂交后的 F1代胚胎用于Plan RG/RH/RI服务。
P{CaryP}系统
Calos实验室通过P-element转基因方法创建了含P{CaryP}attP序列 (位点处有y+) 的两个品系。
Perrimon实验室继续构建了一系列含P{CaryP}attP序列的品系,并以luciferase为报告基因比较了不同组织中的位置效应 (Position Effect)。
Bellen实验室创建了一个在Y染色体上含P{CaryP}attP序列的品系。
详细信息请查看参考文献。
PhiC31-RMCE系统
Wu实验室创建了含P{attP.w+.attP}盒式结构的品系,这样含{attB.目的片段.attB}盒式结果的质粒注射入胚胎,在PhiC31整合酶作用下,通过盒式交换反应得到{attR.目的片段.attR}转基因品系。之后Bateman实验室创建了平衡子上含P{attP.w+.attP}盒式结构的品系。
详细信息请查看参考文献。
P[acman]系统
Bellen实验室创建了P[acman]系统,包括一系列attP位点品系(位点处有y+),并首先应用了含双复制子的attB-BAC质粒 (oriS确保BAC稳定地低拷贝复制和同源重组用;而oriV在条件诱导下高拷贝复制,用以制备质粒) 和“Gap-repair”同源重组技术。
Bellen实验室构建了平均大小为21 kb和83 kb两个P[acman] BAC质粒库,保存于CHORI BACPAC。
详细信息请查看参考文献、Bellen实验室网站和CHORI BACPAC Resources 网站:
http://flypush.imgen.bcm.tmc.edu/lab/index.html
https://bacpacresources.org/library.php?id=444
https://bacpacresources.org/library.php?id=445
FlyC31系统
Basler和Karch实验室创建了一系列含M{3xP3-RFPattP}序列的位点品系。并构建了M{vas-int.Dm}ZH-2A品系,其PhiC31整合酶基因经过果蝇密码子优化,用于PhiC31整合酶的基因组来源。BDSC保存的FlyC31 attP品系已带有M{vas-int.Dm}ZH-2A。
FlyC31特别设计了attP品系及其质粒载体含loxP序列,在转基因完成后可通过Cre/loxP重组反应,切除非必要序列 {3xP3-RFP、w+、载体DNA序列等},只保留loxP-目的片段-attL序列 (我们不提供该服务)。
为了含Fluorescence标记的质粒可以选用FlyC31系统的attP位点,我们通过Cre/loxP反应切除了原始位点的3xP3-RFP序列,构建了对应位点的NF 品系 (位点处没有RFP)。
详细信息请查看参考文献、FlyC31网站和我们网页上的列表。
MiMIC系统
MiMIC系统由Bellen,Hoskins和Spradling实验室联合创建,是基于Minos转座子构建的位点遍布基因组且功能多样的系统,MIMIC品系的两端含attP盒式结构,两端含attB盒式结构的质粒注射入胚胎,在PhiC31整合酶作用下通过盒式交换反应将目的片段插入选定位点。
详细信息请查看参考文献和Bellen实验室网站MiMIC 页面:
http://flypush.imgen.bcm.tmc.edu/pscreen/technique.html
关于以下列表中大多数PhiC31品系不含PhiC31整合酶基因的说明
为了长期稳定地传代,大多数情况下我们保存和采用的是不含PhiC31整合酶基因的attP品系,例如,多数FlyC31 attP品系去除了M{vas-int.Dm}ZH-2A。注射时所用的胚胎是attP品系与含PhiC31整合酶基因的品系杂交后的后代。
关于PhiC31系统和Gateway载体系统的特别说明
“Gateway-PhiC31质粒载体”例子为FlyC31系统的Gateway attB 载体。请注意Gateway载体(例如Murphy 实验室的The Drosophila Gateway? Vector collection) 中attP1、attP2、attB1、attB2与PhiC31系统的attP和attB概念不同。
参考文献:
Groth A, Fish M, Nusse R, Calos MP (2004) Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage PhiC31. Genetics 166: 1775
Markstein M, Pitsouli C, Villalta C, Celniker SE, Perrimon N (2008) Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nature Genetics 40: 476
Szabad J, Bellen HJ, Venken KJT (2012) An Assay to Detect In Vivo Y Chromosome Loss in Drosophila Wing Disc Cells. G3 (Bethesda) 2(9): 1095
Bateman JR, Lee AM, Wu C-t (2006) Site-specific transformation of Drosophila via PhiC31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics 173: 769
Sun FF, Johnson JE, Zeidler MP, Bateman JR (2012) Simplified Insertion of Transgenes Onto Balancer Chromosomes via Recombinase-Mediated Cassette Exchange. G3 2: 551
Venken KJT, He Y, Hoskins RA, Bellen HJ (2006) PhiC31: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in Drosophila melanogaster. Science 314: 1747
Bischof J, Maeda RK, Hediger M, Karch F, Basler K (2007) An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific PhiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci USA 104: 3312
Venken KJT, Schulze KL, Haelterman NA, Pan H, He Y, Evans-Holm M, Carlson JW, Levis RW, Spradling AC, Hoskins RA, Bellen HJ (2011) MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods 8(9): 737
PhiC31整合系统果蝇品系
P{CaryP}品系
位点名称 | BDSC# | 基因型 | Cytosite# |
转基因品系 眼睛颜色1 |
转基因效率评分[平均值(BACs)]2 |
attP18 | 32107 | y1 w67c23 P{CaryP}attP18 | 6C12 | 橙色 | 4.0 (0.0) |
attP4 |
- |
y1 w67c23 P{CaryP}attP4 | 12C6 | 橙色 | 2.5 (0.0) |
attP3 | 32230 | y1 w* P{CaryP}attP3 | 19C4 | 淡橙色 | 0.9 (0.7) |
attP40 | - | y1 w67c23; P{CaryP}attP40 | 25C6 | 红色 | 7.2 (3.7) |
attP30 |
- |
y1 w67c23; P{CaryP}attP30 | 29C3 | 红色 | 4.0 (nd) |
attP14 |
- |
y1 w67c23; P{CaryP}attP14 | 36A10 | 橙色 | 2.7 (1.0) |
attP1 | 8621 | y1 w67c23; P{CaryP}attP1 | 55C4 | 红色 | 6.4 (2.2) |
attP23 |
- |
y1 w67c23; P{CaryP}attP23 | 60C7 | 红色 | - (nd) |
attP88 |
- |
y1 w67c23; P{CaryP}attP88 | 64A12 | 红色 | 4.4 (nd) |
attP2 | 8622 | y1 w67c23; P{CaryP}attP2 | 68A4 | 红色 | 5.8 (1.9) |
attP112 |
- |
y1 w67c23; P{CaryP}attP112 | 68C13 | 红色 | 3.0 (nd) |
attP64 |
- |
y1 w67c23; P{CaryP}attP64 | 89B9 | 红色 | 5.3 (nd) |
attP154 |
- |
y1 w67c23; P{CaryP}attP154 | 97D2 | 橙色 | 6.3 (1.8) |
attPY | 41124 | y1 w*/Dp(2;Y)G; P{CaryP}attPY | Y | 红色 | 4.3 (nd) |
1眼睛颜色是转基因品系在杂合状态下羽化三天后观察的结果
2转化效率评分是基于过往实际订单的统计结果, 分别显示了订单的评分值和>30 kb BAC质粒的评分值
PhiC31-RMCE品系
位点名称 |
参考 BDSC#
|
基因型
|
Cytosite#
|
果蝇品系
眼睛颜色3 |
转基因效率 评分2 |
JB37B |
P{attP.w+.attP}JB37B
|
37B7
|
红色
|
6.8
|
|
JB38F |
P{attP.w+.attP}JB38F
|
38F1
|
橙色
|
6.4
|
|
JB53F |
P{attP.w+.attP}JB53F
|
53F8
|
橙色
|
3.8
|
|
JB89B |
P{attP.w[+].attP}tara[JB89B]
|
89B8
|
红色
|
5.8
|
|
38451 |
w1118; Dr1/TM3, P{attP.w+.attP}FS10 Sb1 Ser1
|
79A2
|
橙色
|
3.3
|
|
38452 |
w1118; Dr1/TM3, Sb1 Ser1 P{attP.w+.attP}FS18
|
100D1
|
橙色
|
2.0
|
|
38453 |
y1 w*; snaSco/CyO, P{attP.w+.attP}J04
|
37B8
|
橙色
|
9.0
|
|
38454 |
y1 w*; snaSco/CyO, P{attP.w+.attP}J08
|
37F2
|
红色
|
4.6
|
|
38455 |
FM7h, P{attP.w+.attP}FS2/C(1)DX, y1 f1
|
10B6
|
红色
|
4.6
|
|
38456 |
FM7h, P{attP.w+.attP}FS5/C(1)DX, y1 f1
|
6F3
|
橙色
|
3.0
|
# FlyBase Drosophila melanogaster (R6.42)
2转化效率评分是基于我们过往实际订单的统计结果, 显示了订单的评分值
3眼睛颜色是羽化三天后观察的结果。这是果蝇品系自身的眼睛颜色而不是转基因品系的眼睛颜色
P[acman]品系
位点名称 |
BDSC# |
基因型 |
Cytosite# |
转基因品系 眼睛颜色1 |
转基因效率评分[平均值 (BACs)]2 |
VK10 |
97294 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00010 |
chromosome 2 |
- |
- (nd) |
VK15 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00015 |
chromosome 2 |
红 |
3.3 (2.4) |
|
VK38 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00038 |
5B8 |
红 |
4.1 (0.8) |
|
VK06 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00006 |
19E7 |
淡橙色 |
1.9 (1.3) |
|
VK37 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00037 |
22A3 |
橙色 |
5.8 (2.4) |
|
VK12 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00012 |
25A3 |
淡橙色 |
0.5 (nd) |
|
VK02 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00002 |
28E7 |
红 |
6.4 (2.7) |
|
VK11 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00011 |
40E4 |
红 |
0.5 (0.0) |
|
VK14 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00014 |
43A1 |
橙色 |
6.4 (2.7) |
|
VK16 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00016 |
47C6 |
橙色 |
5.0 (3.2) |
|
VK30 |
9747 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00030 |
50E1 |
橙色 |
3.7 (1.4) |
VK18 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00018 |
53B2 |
橙(可能斑驳) |
6.6 (2.6) |
|
VK22 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00022 |
57F5 |
橙色 |
6.9 (2.9) |
|
VK01 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00001 |
59D3 |
橙色 |
4.8 (3.8) |
|
VK31 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00031 |
62E1 |
橙色 |
6.3 (2.8) |
|
VK33 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00033 |
65B2 |
红 |
6.2 (3.5) |
|
VK39 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00039 |
67E4 |
- |
4.8 (nd) |
|
VK19 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00019 |
68D2 |
红 |
4.2 (1.9) |
|
VK23 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00023 |
70A2 |
红 |
4.7 (3.8) |
|
VK36 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00036 |
70C4 |
红 |
4.0 (nd) |
|
VK05 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00005 |
75A10 |
橙色 |
7.2 (2.2) |
|
VK13 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00013 |
76A2 |
红 |
6.0 (4.4) |
|
VK21 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00021 |
76C5 |
橙色 |
- (nd) |
|
VK07 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00007 |
82A1 |
橙色 |
2.7 (0.0) |
|
VK32 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00032 |
85A2 |
淡橙色 |
1.4 (0.0) |
|
VK40 |
PBac{yellow[+]-attP-3B}VK00040 |
87B10 |
红 |
7.2 (1.4) |
|
VK27 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00027 |
89E11 |
红 |
7.6 (1.8) |
|
VK26 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00026 |
96F3 |
淡橙色 |
2.7 (3.8) |
|
VK20 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00020 |
99F8 |
淡橙色 |
4.8 (3.6) |
|
VK24 |
97424 |
PBac{yellow[+]-attP-9A}VK00024 |
101F1 |
- |
0.0 (nd) |
# FlyBase Drosophila melanogaster (R6.42)
1眼睛颜色是转基因品系在杂合状态下羽化三天后观察的结果
2转化效率评分是基于过往实际订单的统计结果, 分别显示了订单的评分值和>30 kb BAC质粒的评分值
4这些品系很难得到转基因品系
FlyC31品系
位点名称 |
参考 BDSC#
|
基因型
|
CytoSite#
|
转基因品系
眼睛颜色1 |
转基因效率评分 [平均值 (BACs)]2
|
ZH-2A |
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-2A
|
2A3
|
橙色
|
3.3 (0.6)
|
|
ZH-22A |
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-22A
|
22A2
|
淡橙色
|
5.2 (3.4)
|
|
ZH-51C |
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-51C
|
51C1
|
淡橙色
|
7.5 (4.9)
|
|
ZH-51D |
M{3xP3-RFP.attP}ZH-51D
|
51D9
|
红
|
6.2 (2.4)
|
|
ZH-58A |
M{3xP3-RFP.attP}ZH-58A
|
58A3
|
淡橙色
|
7.0 (5.5)
|
|
ZH-68E |
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-68E
|
68E1
|
淡橙色
|
6.8 (2.9)
|
|
ZH-86Fa |
M{3xP3-RFP.attP'}ZH-86Fa
|
86E18
|
红
|
7.0 (3.8)
|
|
ZH-86Fb |
M{3xP3-RFP.attP}ZH-86Fb
|
86F8
|
红
|
7.3 (4.3)
|
|
ZH-102D |
M{3xP3-RFP.attP}ZH-102D (with M{vas-int.Dm}ZH-2A)
|
102F4
|
红
|
7.3 (4.0)
|
|
24480NF |
-
|
24480NF6 ZH-2A
|
2A3
|
橙色
|
2.0 (nd)
|
24481NF |
-
|
24481NF7 ZH-22A
|
22A2
|
淡橙色
|
- (0.0)
|
24482NF |
-
|
24482NF7 ZH-51C
|
51C1
|
橙色
|
2.0 (nd)
|
24483NF |
-
|
24483NF7 ZH-51D
|
51D9
|
红
|
3.4 (nd)
|
24484NF |
-
|
24484NF7 ZH-58A
|
58A3
|
淡橙色
|
1.3 (nd)
|
24485NF |
-
|
24485NF7 ZH-68E
|
68E1
|
淡橙色
|
1.1 (0.0)
|
24486NF |
-
|
24486NF7 ZH-86Fa
|
86E18
|
红
|
5.9 (nd)
|
24749NF |
-
|
24749NF7 ZH-86Fb
|
86F8
|
红
|
8.3 (2.4)
|
# FlyBase Drosophila melanogaster (R6.42)
1眼睛颜色是转基因品系在杂合状态下羽化三天后观察的结果
2转化效率评分是基于过往实际订单的统计结果, 分别显示了订单的评分值和>30 kb BAC质粒的评分值
5位点受临近hibris基因Enhancer trap影响,不适用于报告基因的分析研究或异位表达 (ectopic expression)造成影响的情况。
6去除M{vas-int.Dm}ZH-102D和loxP-3xP3-RFP,即位点为M{loxP. attP’}的品系
7去除M{vas-int.Dm}ZH-2A和loxP-3xP3-RFP,即位点为M{loxP. attP}或M{loxP. attP’}的品系
8Plan I不适用
其它品系
位点名称
|
BDSC#
|
基因型
|
CytoSite#
|
转基因品系
眼睛颜色1 |
转基因效率评分[平均值(BACs)]2
|
su(Hw)attP8
|
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP8
|
8E10
|
红
|
3.8 (0.0)
|
|
su(Hw)attP6
|
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP6
|
24A2
|
红
|
2.0 (nd)
|
|
su(Hw)attP5
|
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP5
|
50F1
|
红
|
6.2 (5.0)
|
|
su(Hw)attP4
|
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP4
|
67E2
|
红
|
2.0 (nd)
|
|
su(Hw)attP2 |
y1 w* P{CaryIP}su(Hw)attP2
|
92D9 |
红 |
4.8 (nd) | |
-
|
3476910
|
y1 P{CaryIP}su(Hw)attP8 v1
|
8E10
|
-
|
6.0 (nd)
|
VIE260B
|
P{attP,y+,w3'}VIE-260B
|
40D3
|
红
|
8.5 (nd)
|
|
JK22C aka JMK-96
|
-
|
w1118; P{CaryP}JK22C
|
22C3
|
红
|
5.9 (0.0)
|
JK65C aka JMK-98
|
-
|
w1118; P{CaryP}JK65C
|
65C3
|
红
|
5.5 (0.0)
|
JK66B aka JMK-99
|
-
|
w1118; P{CaryP}JK66B
|
66B4
|
红
|
3.8 (1.2)
|
# FlyBase Drosophila melanogaster (R6.42)
1眼睛颜色是显微注射、筛选得到的转基因品系在杂合状态下羽化三天后观察的结果
2转化效率评分是基于过往实际订单的统计结果, 分别显示了订单的评分值和>30 kb BAC质粒的评分值
9非特异性整合率较高,建议选用Service W(PCR确认转基因位点)
10该品系适于筛选标记为vermilion+、attP位点在X染色体的转基因服务