果蝇基因组工程


概述  

      CRISPR/Cas9TALENZFN是三种高效的基因组编辑工具,它们通过设计序列特异性的核酸结合元件,协同核酸酶在基因组的目标序列处造成双链断裂 (double-strand break, DSB), 激发非同源末端连接 (Non-homologous end joining, NHEJ) 或同源重组 (homologous recombination, HR) 修复机制。NEHJ途径能够在断裂末端处随机引入短序列插入或删除 (indel) 或突变;而提供含同源臂的供体DNA,通过同源重组修复机制 (HDR) 能够精确地编辑目标序列。

    目前,CRISPR/Cas9系统在果蝇基因组编辑中应用最为广泛。


CRISPR/Cas9系统

      CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR associated, 成簇的规律间隔的短回文重复序列/CRISPR相关) 系统是一种存在于细菌、古细菌中的天然免疫系统。IICRISPR/Cas9系统利用crRNAs (~20nt) 识别外源DNA的互补序列,其后在trans-activating crRNA (tracrRNA) 的辅助下,Cas9内切酶结合识别位点形成Cas9复合体,激活酶活性,切断识别位点的序列形成双链断裂。  


   基因组


  CRISPR/Cas9系统在果蝇基因组编辑的应用中,通常将crRNAtracrRNA构成一个嵌合体RNA (chiRNA或gRNA)。系统要求gRNA的目标序列需要紧跟NGGNAG PAM序列 (protospacer adjacent motif),通过编辑gRNA~20 bp识别序列,引导Cas9内切酶在目标序列处形成双链断裂。

        因为CRISPR/Cas9系统是通过RNA-DNA特异性识别而工作,Cas9内切酶可以同时切断多个gRNA目标位点,这样有利于对多个目标序列进行编辑,或通过同源重组修复机制对目标序列段进行精确的敲除、敲入或置换。


  

详细信息请查看以下网站:

flyCRISPR

FlyCas9

CRISPR fly design

基于D.melanogaster genome assembly 6DRSC Find CRISPR Tool 可在果蝇全基因组范围内选择或设计CRISPR目标位点,并且CRISPR Efficiency Predictor 工具可用于估计gRNA目标序列的剪切效率。

考虑到您选择的果蝇品系与已公布的基因组序列可能存在多态性,flyCRISPR Optimal Target Finder 可以采用您提供的DNA序列识别gRNA的目标位点,并可参考已知的基因组序列对这些位点的进行评估(例如,脱靶情况),参考序列包括D.melanogaster release 6、vas-Cas9(III) (BDSC#51324) 、nos-Cas9 在 II 和 III上(BDSC#78781BDSC#78782)全基因组序列等。


参考文献

Gratz SJ, Cummings AM, Nguyen JN, Hamm DC, Donohue LK, Harrison MM, Wildonger J, and O'Connor-Giles KM (2013) Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics 194: 1029-1035

Gratz SJ, Wildonger J, Harrison MM, and O'Connor-Giles KM (2013) CRISPR/Cas9-mediated genome engineering and the promise of designer flies on demand. Fly (Austin) 7

Bassett AR, Tibbit C, Ponting CP, Liu JL (2013) Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep 4(1): 220
Kondo S, Ueda R (2013) Highly improved gene targeting by germline-specific Cas9 expression in Drosophila. Genetics 195(3): 715

Port F, Chen HM, Lee T, Bullock SL (2014) Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. PNAS 111(29): E2967

Port F, Muschalik N, Bullock SL (2015) Systematic evaluation of Drosophila CRISPR tools reveals safe and robust alternatives to autonomous gene drives in basic research. G3 5(7): 1493

Ren XJ, Sun J, Housden BE, Hu YH, Roesel C, Lin SL, Liu LP, Yang ZH, Mao DC, Sun LZ, Wu QJ, Ji JY, Xi JZ, Mohr SE, Xu J, Perrimon N, Ni JQ (2013) Optimized gene editing technology for Drosophila melanogaster using germ line-specific Cas9. PNAS 110(47): 19012

Ren X, Yang Z, Xu J, Sun J, Mao D, Hu Y, Yang SJ, Qiao HH, Wang X, Hu Q, Deng P, Liu LP, Ji JY, Li JB, Ni JQ (2014) Enhanced specificity and efficiency of the CRISPR/Cas9 system with optimized sgRNA parameters in Drosophila. Cell Rep 9(3): 1151

Zhang X, Koolhaas WH, Schnorrer F. (2014) A Versatile Two-Step CRISPR- and RMCE-Based Strategy for Efficient Genome Engineering in Drosophila. G3 4(12): 2409


CRISPR/Cas9系统果蝇品系


flyCRISPR 品系

种名 种库号 基因型 描述 备注
vas-Cas9(X) BDSC#51323 y[1] M{vas-Cas9}ZH2A w[1118] Cas9的表达受控于vas调控序列,位于ZH-2A (2A3) 位点。Cas9构建质粒含3xP3-GFP标记,attP位点含3xP3-RFP标记 RFP+ GFP+
vas-Cas9(X) RFP- BDSC#55821 y[1] M{vas-Cas9.RFP-}ZH-2A w[1118] 与51323/51324相同的Cas9构建质粒注射BDSC#24480NF - 去除M{vas-int.Dm}ZH-102D和loxP-3xP3-RFP的果蝇品系 GFP+ RFP-
vas-Cas9(II) BDSC#56552 w[1118]; PBac{y[+mDint2]=vas-Cas9}VK00037/CyO, P{w[+mC]=Tb[1]}Cpr[CyO-A] Cas9的表达受控于vas调控序列,位于VK00037 (22A3) 位点。 Cas9构建质粒含3xP3-GFP标记。w+ 位于CyO平衡子上 y+ GFP+ w+ CyO
vas-Cas9(III) BDSC#51324 w[1118]; PBac{y[+mDint2]=vas-Cas9}VK00027 Cas9的表达受控于vas调控序列,位于VK00027 (89E11) 位点。 Cas9构建质粒含3xP3-GFP标记。另有w[1118]; PBac{y[+mDint2]=vas-Cas9}VK00027/TM6B, Tb[1],即带平衡子的品系 y+ GFP+(带平衡子的品系有TM6B Tb)


FlyCas9 品系

种名 种库号 基因型 描述 备注
nos-Cas9(X) NIG-FLY#CAS-0002 y2 cho2 v1 P{nos-Cas9, y+, v+}1A/FM7c, KrGAL4 UAS-GFP Cas9的表达受控于nos调控序列,位于X染色体 y+ v+ (红眼)
nos-Cas9(II-attP40) NIG-FLY#CAS-0001 y2 cho2 v1; attP40{nos-Cas9}/CyO Cas9的表达受控于nos调控序列,位于II染色体attP40 (25C6)位点 y+ v+ (v+ 较难观察到,红眼 )
yw; nos-Cas9(II-attP40) - y1 w1118; attP40{nos-Cas9}/CyO yw背景(果蝇更健康),Cas9的表达受控于nos调控序列, 位于II染色体attP40 (25C6)位点 y+ CyO (白眼)
nos-Cas9(II-2A) NIG-FLY#CAS-0004 y2 cho2 v1; Sp/CyO, P{nos-Cas9, y+, v+}2A Cas9的表达受控于nos调控序列,位于II染色体CyO平衡子上 y+ v+ Sp CyO (v+ 较难观察到,红眼)
yw; nos-Cas9(III-attP2) - y1 w1118; attP2{nos-Cas9}/TM6C,Sb Tb yw背景(果蝇更健康),Cas9的表达受控于nos调控序列, 位于III染色体attP2 (68A4)位点 y+ TM6C Sb Tb(白眼)
nos-Cas9(III-3A) NIG-FLY#CAS-0003 y2 cho2 v1; P{nos-Cas9, y+, v+}3A/TM6C, Sb Tb Cas9的表达受控于nos调控序列,位于III染色体 y+ v+ TM6C Sb Tb (v+ 较难观察到,红眼)


CRISPR fly design 果蝇品系*

种名 种库号 基因型 描述 备注
Act5C-Cas9.P aka CFD1 BDSC#54590 y[1] M{w[+mC]=Act5C-Cas9.P}ZH-2A w[*] Cas9的表达受控于Act5C调控序列,广泛表达。插入位点为ZH-2A(2A3) w+ RFP+
nos-Cas9.P aka CFD2 BDSC#54591 y[1] M{w[+mC]=nos-Cas9.P}ZH-2A w[*] Cas9的表达受控于nanos调控序列。插入位点为ZH-2A(2A3) w+ RFP+
UAS-Cas9.P aka CFD4 BDSC#54594 P{ry[+t7.2]=hsFLP}1, y[1] w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-Cas9.P}attP40 Cas9的表达受控于UAS。hsFLP的插入是猜测。插入位点为attP40(25C6) y+ w+
UAS-Cas9.P aka CFD3 BDSC#54592 P{ry[+t7.2]=hsFLP}1, y[1] w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-Cas9.P}attP2/TM6B, Tb[1] Cas9的表达受控于UAS调控序列。hsFLP的插入是猜测。插入位点为attP2(68A4) y+ w+ TM6B Tb
nos-Gal4/UAS-Cas9.P aka CFD3-nos BDSC#54593 P{ry[+t7.2]=hsFLP}1, y[1] w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC=UAS-Cas9.P}attP2 P{w[+mC]=GAL4::VP16-nos.UTR}CG6325[MVD1] Cas9的表达受控于UAS 调控序列。GAL4在卵子形成期表达。nos-GAL4和hsFLP的插入是猜测。插入位点为attP2(68A4), 86B4 y+ w+
act-Cas9(D10A) (nickase) aka CFD13 - P{ry[+t7.2]=hsFLP}1, y[1] w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=act-Cas9D10A}attP2 Cas9的表达受控于Act5C调控序列。Cas9基因含有D10A突变,因此将Cas9核酸酶转变成切口酶。插入位点为attP2(68A4) y+ w+

*该表中的Cas9果蝇品系我们只接受Plan RH/RI订单


nos-Cas9 果蝇品系*

种名 种库号 基因型 描述 备注
TH_attP40 nos-Cas9 BDSC#78781 y[1] sc[*] v[1] sev[21];{nos-Cas9}attP40/CyO Cas9的表达受控于nos调控序列, 位于II染色体attP40 (25C6)位点 y+ v+ CyO
TH_attP2 nos-Cas9 BDSC#78782 y[1] sc[*] v[1] sev[21];{nos-Cas9}attP2 Cas9的表达受控于nos调控序列, 位于III染色体attP2 (68A4)位点 y+ v+

*该表中的Cas9果蝇品系的X染色体的sevenless基因有一个sev[21] LOF突变使用时请留意。


Act5C-Cas9, Lig4果蝇品系

种名 种库号 基因型 描述 备注
Act5C-Cas9, Lig4 (X) BDSC#58492 y[1] M{Act5C-Cas9.P.RFP-}ZH-2A w[1118] Lig4[169] M{Act5C-Cas9.P}ZH-2A果蝇品系,已经通过cre/loxP切除miniwhite和3xP3-RFP。Act5C-Cas9位于lig4169背景的X染色体上 RFP-


创建稳定的gRNA表达品系

为了创建稳定的attP-gRNA表达品系,您可以采用PhiC31列表中vermillion+背景、attP在常染色体上的品系我们注射后的G0代成虫与y-v-杂交后筛选v+ G1代,交付您的v+ G2代转基因品系与从v-背景的 attP品系得到的相同。如果v+ 转基因需要在X染色体上,请选用X染色体v-背景的attP品系,例如BDSC#34769。这只是常规的Plan HPlan I 服务,附加vermilion+筛选。您也可以请我们保留attP-gRNA品系,它与Cas9品系杂交后的 F1代胚胎用于Plan RG/RH/RI服务。